The Miracle Of Biology: งานชิ้นที่ 3

DNA สายผสมที่ได้จากการตัดและต่อนี้ยังไม่สามารถทำงานได้ต้องมีวิธีการที่จะดำรง DNA สายผสมให้คงอยู่และเพิ่มจำนวนเพื่อใช้ในการศึกษาว่า สาย DNA เหล่านั้นควบคุมการสร้างโปรตีนชนิดใดและศึกษาว่า DNA ยีนอะไรบ้าง สิ่งที่จำเป็นคือ จะต้องเพิ่ม DNA ในบริเวณดังกล่าวให้มากพอที่จะศึกษาได้ การเพิ่ม DNA ที่เหมือนกันนั้นเรียกว่า “การโคลนดีเอ็นเอ (DNA cloning)” หาก DNA บริเวณดังกล่าวเป็นยีนก็อาจเรียกว่า “การโคลนยีน (gene cloning)”

การโคลนยีนโดยอาศัยพลาสมิดของแบคทีเรีย

การโคลนยีนวิธีหนึ่งที่เป็นที่นิยมกัน คือ อาศัยวิธีการเพิ่มจำนวนชุดของ DNA ในพลาสมิด (plasmid) ของแบคทีเรีย ซึ่งถือว่าเป็น DNA พาหะ (vector) สำหรับการโคลน DNA อย่างหนึ่งในแบคทีเรีย 1 เซลล์ อาจมีพลาสมิด 1 - 300 ชุด เมื่อนำเซลล์แบคทีเรียไปเลี้ยงเพื่อเพิ่มจำนวนชุดของพลาสมิดก็จะ เพิ่มขึ้นด้วย ซึ่งส่วนของ DNA ที่ต้องการที่แทรกไว้ไนพลาสมิดก็จะเพิ่มขึ้นตามโดยปริยาย หากส่วนของ DNA ที่แทรกไว้เป็นยีนก็อาจนำไปใช้ประโยชน์ต่อไป

ภาพที่ 1 ภาพแสดงการโคลน DNA โดยอาศัยพลาสมิด
ที่มา : http://thaigoodview.com/node/46405

การเพิ่มปริมาณ DNA เป้าหมาย หรือยีนในเซลล์ผู้รับ หลังจากที่ตัดต่อและถ่ายเข้าไปแล้ว ถ้าเป็นในเซลล์แบคทีเรีย สามารถทำได้โดยเลี้ยงแบคทีเรียในอาหารเพาะเลี้ยงเชื้อ เพื่อให้ได้หลายโคโลนี หากทำในเซลล์พืชหรือสัตว์ ก็สามารถเลี้ยงเซลล์นั้นในอาหารเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อได้ นอกจากนั้นยังสามารถทำให้เกิดการพัฒนาเป็นต้นอ่อนหรือตัวอ่อน (embryo) และตัวโตเต็มวัยได้ด้วย

ภาพที่ 2 การโคลนยีนในแบคทีเรียโดยใช้พลาสมิดเป็นเวคเตอร์

ที่มา: http://www.il.mahidol.ac.th/e-media/dna/chapter/chapter4application.htm

ภาพที่ 3 การโคลนยีนในพืชโดยใช้พลาสมิดเป็นเวคเตอร์
ที่มา http://www.il.mahidol.ac.th/e-media/dna/chapter/chapter4application.htm

การโคลนยีนในหลอดทดลองโดยเทคนิค พอลิเมอเรสเชนรีแอกชัน หรือ พีซีอาร์

เทคนิคพีซีอาร์ (PCR) มีชื่อเต็มว่าเทคนิคปฏิกิริยาลูกโซ่โพลิเมอเรส (Polymerase Chain Reaction) เป็นเทคนิคเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมคือดีเอ็นเอ ให้มีปริมาณมากเป็นล้านเท่า ในระยะเวลาอันรวดเร็ว โดยอาศัยหลักการจำลองตัวของสายดีเอ็นเอ (DNA Replication) เลียนแบบกระบวนการสังเคราะห์ดีเอ็นเอในสิ่งมีชีวิตตามธรรมชาติ ที่มีการสร้างสายดีเอ็นเอสายใหม่อีกหนึ่งสายจากดีเอ็นเอเดิม

ภาพที่ 4 ภาพการจำลอง DNA

ที่มา http://blog.janthai.com

ในปัจจุบันสามารถเพิ่มจำนวน DNA ในหลอดทดลองได้แล้ว โดยใช้เครื่องมือที่เรียกว่า “เทอร์มอไซเคลอร์ (thermocycler)” โดยเครื่องมือนี้สามารถควบคุมอุณหภูมิให้ปรับเปลี่ยนตามกำหนดเวลาที่ตั้งไว้ได้ ในการโคลนยีนโดยใช้เทคนิคพอลิเมอเรสเชนรีแอกชัน หรือ พีซีอาร์ (polymerase chain reaction ; PCR) นี้ต้องอาศัยเอนไซม์ DNA พอลิเมอเรส (DNA polymerase) ชนิดพิเศษที่ทนความร้อนหรือทนที่ที่มีอุณหภูมิสูงได้โดยเอนไซม์ชนิดพิเศษนี้จะแยกออกมาจากแบคทีเรียที่อาศัยอยู่บริเวณน้ำพุร้อนซึ่งจะทนสภาพ อุณหภูมิสูงได้

สิ่งที่ต้องใช้ในการทดลอง คือ

1. DNA แม่แบบ (DNA template) ซึ่งเป็น DNA ที่ต้องการโคลนหรือ

  เพิ่มจำนวน

              2. DNA ไพรเมอร์ (DNA primer) เป็น DNA สายสั้นๆ ที่ใช้เกาะกับ DNA ที่

ต้องการโคลนเพื่อเป็นจุดเรื่ม
ต้นในการสังเคราะห์สาย DNA

3. นิวคลีโอไทด์ทั้ง 4 ชนิด ประกอบด้วย dATP (A) , dGTP (G) , dCTP (C)

และ dTTP (T)

                4. เอนไซม์ DNA พอลิเมอเรส ชนิดพิเศษ

ภาพที่ 5 (เครื่องมือที่เรียกว่า "เทอร์มอไซเคลอร์ (thermocycler)")

ที่มา : http://www.thaigoodview.com/node/46418

เทคนิคนี้พัฒนาขึ้นเมื่อปี 2528 โดยแกรี มุลลิส (Kary B. Mullis) และคณะ แห่งบริษัทซีตัส (Cetus Corporation) สหรัฐอเมริกา ทำให้ให้เขาได้รับรางวัลโนเบลในปี 2537 ปัจจุบันเทคนิคพีซีอาร์ได้รับการปรับปรุงและพัฒนาจนประยุกต์ใช้ได้ในหลายด้าน และได้รับการยอมรับว่าเป็นเทคโนโลยีที่สำคัญมากต่องานวิจัยด้านเทคโนโลยีชีวภาพ

ภาพ 6 ก ภาพ6 ข

แกรี มุลลิส (Kary B. Mullis)ผู้พัฒนาเทคนิค PCR

ที่มาภาพ : 6ก http://photosynthesis.com/images-titles/P339-98.

6ข http://edge.org/documents/archive/edge177.html

: : หลักการทำงานของเทคนิคพีซีอาร์
เทคนิคนี้ใช้หลักการพื้นฐานในการเพิ่มดีเอ็นเอด้วยการจำลองดีเอ็นเอสายใหม่

จากสายดีเอ็นเอที่เป็นต้น

แบบหนึ่งสาย ด้วยเอนไซม์ดีเอ็นเอโพลีเมอเรส

(DNA polymerase) โดยใช้ดีเอ็นเอเริ่มต้นหรือไพรเมอร์ (Primer) 1 คู่ ทำให้สังเคราะห์ดีเอ็นเอได้คราว

ละ 2 สายพร้อมกัน ประกอบด้วยปฏิกิริยาสำคัญ 3 ขั้นตอน และหมุนเวียนต่เนื่องกันไป ภายใต้สภาวะ

ที่เหมาะสมของแต่ละขั้นตอน

ภาพที่ 7หลักการทำงานของเทคนิคพีซีอาร์

ที่มาภาพ : http://www.pseudomonas-syringae.org/Outreach/Module_3_Home.htm

           : : ขั้นแรก เรียกว่า Denaturation เป็นการแยกสายดีเอ็นเอที่เป็นต้นแบบจากสภาพที่เป็นเส้นคู่ให้เป็นเส้นเดี่ยวโดยใช้อุณหภูมิในช่วง 92-95 องศาเซลเซียส
           : : ขั้นที่สอง เรียกว่า Annealing เป็นขั้นตอนที่ลดอุณหภูมิลงอยู่ในช่วง 50-60 องศาเซลเซียส และใช้ไพรเมอร์ซึ่งเป็นดีเอ็นเอสายสั้น ๆ (ประกอบด้วยนิวคลีโอไทด์จำนวน 17-24 เบส) ที่มีลำดับเบสเป็นเข้าคู่กับสายดีเอ็นเอที่เป็นต้นแบบจับคู่กัน
           : : ขั้นที่สาม เรียกว่า Extension หรือ Synthesis of new DNA ซึ่งเป็นขั้นตอนการสร้างดีเอ็นเอสายใหม่โดยสังเคราะห์ต่อจากส่วนปลายของไพรเมอร์ (ที่ใส่เข้าไปในขั้นที่สอง) ตามข้อมูลบนดีเอ็นเอที่เป็นต้นแบบแต่ละสายโดยอาศัยการทำงานของเอ็นไซม์ดีเอ็นเอโพลิเมอร์เรส (DNA polymerase) ซึ่งเอนไซม์นี้ทำงานได้ดีที่สุดที่อุณหภูมิ 72-75 องศาเซลเซียส

จากขั้นตอนที่ 1-3 ซึ่งนับเป็นจำนวน 1 รอบ (One cycle) ให้ผลผลิตเป็นดีเอ็นเอสายคู่ที่มีลำดับเบสเป็นคู่สม (หรือเข้ากัน) กับดีเอ็นเอที่เป็นต้นแบบ เพิ่มขึ้นเป็นสองเท่า และเมื่อจัดให้เกิดปฏิกิริยาลูกโซ่จากขั้นที่ 1 ถึง 3 หมุนเวียนไปอีกหลาย ๆ รอบ จะเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอได้จำนวนมาก ประมาณว่าปฏิกิริยา 30 - 40 รอบ สามารถเพิ่มปริมาณสารดีเอ็นเอได้ไม่น้อยกว่าพันล้านเท่า ดังนั้น แม้ตัวอย่างที่นำมาศึกษามีปริมาณสารพันธุกรรมน้อยมาก เราก็ใช้เทคนิคพีซีอาร์เพิ่มจำนวนได้หลายเท่าทวีคูณ

ภาพที่ 8 "เทคนิคการถ่ายสำเนาโมเลกุล"
ที่มาภาพ :

http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/1993/illpres/pcr.html

ดีเอ็นเอที่เกิดจากเทคนิคนี้ในหลอดทลอง มองไม่เห็นด้วยตาเปล่า ดังนั้นเพื่อตรวจหาดีเอ็นเอผลผลิต ต้องนำตัวอย่างที่ทำพีซีอาร์มแยกหาดีเอ็นเอโดยใช้เทคนิคที่เรียกว่าอะกาโรสเจลอิเล็กโตรโฟริสิส (Agarose gel electrophoresis) ซึ่งเป็นการแยกดีเอ็นเอด้วยกระแสไฟฟ้าบนแผ่นวุ้น (Agarose gel) โดยระยะทางที่ดีเอ็นเอเคลื่อนที่ไปได้ขึ้นกับขนาดของดีเอ็นเอและกระแสไฟฟ้าที่ใช้ ดีเอ็นเอที่แยกโดยวิธีนี้ มองเห็นได้เมื่อย้อมด้วยสีพิเศษ ซึ่งเรืองแสงภายใต้แสงอุลตร้าไวโอเลต